【答案】D

【解析】细菌和真菌的生活需要一定的条件，如水分、适宜的温度、还有有机物。因此首先要配制含有营养物质的培养基，可以用牛肉汁加琼脂熬制，然后把培养基和所有用具进行高温灭菌，以防杂菌对实验的干扰，为防止高温杀死细菌、真菌，要等冷却后，再进行接种，接种后放在温暖的培养箱中进行恒温培养。注意：定期观察并详细记录实验现象。因此培养细菌、真菌的一般方法中，正确的操作顺序是①配制培养基、③高温灭菌冷却、②接种、④恒温培养。
故选D。